Watchmaker 酶法片段化 DNA 文库制备试剂盒的推荐应用是什么？
该试剂盒旨在将质量可变的 DNA 高效转化为与 Illumina 兼容的测序准备文库，因此支持多种应用，包括：
- 全基因组测序 (WGS)
- 全外显子组测序 (WES)
- 利用杂交捕获进行靶向测序
- 低起始量且具有挑战性的样品，如福尔马林固定石蜡包埋
- 宏基因组分析
- RNA 测序（使用 cDNA 作为起始）
我是否该涡旋酶法片段化、末端修复和加 A（片段/AT）反应？
是。充分涡旋预混液的组分和片段化/加A反应，确保样品之间的片段化结果一致。当制备少量反应时，可以通过移液管混合。
Watchmaker 酶法片段化 DNA 文库制备试剂盒是否与福尔马林固定石蜡包埋 DNA 兼容？
试剂盒与从福尔马林固定石蜡包埋中提取的 DNA 兼容。从福尔马林固定石蜡包埋中提取的 DNA 可能具有不同程度的交联或其他化学修饰，这可能会影响片段长度和/或起始量 DNA 到测序文库的转换效率。确保提取方案针对样品类型进行了优化。在开始制备文库之前，通过 qPCR 评估 DNA 质量可以告知所需应用的起始量质量要求。
为了满足与完整 DNA 相同的片段长度图谱，福尔马林固定石蜡包埋可能需要更短的片段化时间。首先，将片段化时间缩短一半，以获得与完整 DNA 相同的插入物大小。可能需要进一步优化。
随着起始量 DNA 的增加/减少，我应该如何修改酶法片段化条件？
试剂盒中使用的化学物质在推荐的起始量范围内产生一致的片段大小。在相同条件下，1 ng 起始量的片段大小将与相同质量样品的 500 ng 起始量质量样品的片段大小相匹配。
将 500、10 和 0.1 ng 人类基因组 DNA 在 37°C 下片段化 20 分钟，重复构建两个文库。采用 TapeStation（Agilent）D1000 检测评估最终文库大小分布。
如何调整不同起始量的接头浓度？
| DNA 起始量 (ng) | 接头浓度* | 接头：插入物摩尔比 |
|---|---|---|
| 10 – 500 | 15 µM | 最多 1500:1 |
| 1 – 10 | 3 µM | 300 – 3000:1 |
| < 1 | 0.6 µM | > 300:1 |
*基于 300 bp 片段大小估计的接头-插入物比率；超过 50 ng 的起始量将使用相同体积和浓度的接头；对于小于 10 ng 的质量，计算维持接头与插入物 300:1 浓度所需的浓度。
推荐的试剂盒起始量是多少？
该试剂盒在广泛的起始量范围（1 ng – 500 ng）兼容。当使用高质量的 DNA 起始量时，转换效率在此起始范围内很高。
How much input do I need to generate sequenceable concentration of library?
最佳起始量范围将取决于应用。当预期的目标文库浓度为 5 nM 时，我们建议以至少 20 ng –30 ng 作为起点，生成 200 bp 插入物长度的文库（例如，全外显子组测序）。For PCR-free WGS workflows targeting >400 bp inserts lengths, we recommend starting with ~100 ng of input DNA. 产量可能会因进入流程的 DNA 质量差异而有所不同（福尔马林固定石蜡包埋样品需要更多质量的起始量）。
PCR-Free 工作流程是否有什么特殊考虑？
确保使用足够的 DNA 起始量来创建足够的文库，以便在不进行扩增的情况下进行 QC 和测序。100 ng 高质量 DNA 是很好的起点，尽管可以从 50 ng 或更少的 DNA 生成高质量的文库。福尔马林固定石蜡包埋 DNA 可能需要更多的起始量，并且会因样品而异。需要全长接头，因为不可能通过 PCR 将样品条形码或 P5/P7 序列引入文库。
注：鉴于接头的结构，PCR-Free 文库会比实际的在 TapeStation 和 Bioanalyzer 等电泳分析仪上显示的长度更长。
哪些接头与 Watchmaker 酶法片段化 DNA 文库制备试剂盒兼容？
任何带有 3' 悬垂 T 的接头都是兼容的。请注意，接头质量会影响文库的整体制备效率。
以下是 IDT 的一些选项：
- xGen 短型接头和 UDI 引物（目录号 10005976 或 10005921）。这种解决方案包括在连接过程中将一个短型或截短的 Y 型接头连接到文库，然后在文库扩增过程中添加带有 PCR 引物的独特双端索引，以引入样品标签用于多重测序。
- xGen UDI-UMI 接头（目录号 10006914 和 10005903）。这些是全长 Y 形接头（独特的双端样品条形码，带有可选的独特分子标签），可以连接。如果在文库构建中起始量足够，则这些可用于 PCR-Free 的应用。
对于我们目前运行的片段化工作流程，所有样品在开始片段化之前都要经过 3X SPRI 微珠纯化，以确保样品均在 Tris 而非 TE 中洗脱。您是否建议在我们的方案中保持此微珠纯化，以获得最佳片段化效果？
乙二胺四乙酸（EDTA）可能会影响片段化效果，但具体取决于反应中 EDAT 的最终浓度。经验证，在最终 50 ul 反应中可耐受 0.1 mM 的 EDTA。如果 EDTA 在 50 µL 中超过 0.1 mM，建议进行纯化步骤。
我是否可以将 PCR 产物或扩增子与 Watchmaker 酶法片段化 DNA 文库制备试剂盒结合使用？
是，用户指南中建议的片段化时间适用于 gDNA 和 PCR 产物，因此无需进一步优化。同一实验中在相同的片段化条件下，对高质量的人类 gDNA、质粒 DNA（约 5 kb）和 1.1 kb PCR 产物进行片段化，得到了相当的片段长度。
我的片段尺寸比预期的要小。我应该如何处理样品，以使我的片段长度符合用户指南中预期的长度？
根据用户指南中的建议，有两点需要重点关注，以帮助获得最佳的片段长度。目标是确保在放入热循环器后才开始片段化反应。这可通过在制备过程中始终保持所有反应组分处于低温环境来实现。以下是一些建议：
- 使片段化酶和缓冲液在冰中平衡。
- 确保 DNA 样品（40 µL）在冰中预冷。如果用于稀释 DNA 储备液的稀释剂储存在室温下，应特别注意在反应前使样品重新充分冷却。我们发现这些非常有效。
- 向在冰中的 DNA 样品中加入冷冻的酶和缓冲液。
- 在热循环之前混合反应时，快速执行此步骤，以最大程度降低任何潜在的温度升高。将反应保持在冰中，直至直接转移至预冷的热循环器中。确保热循环器上的升温速率设置为默认值（与较慢的升温速率相反）。
对于片段长度的批次效应而言，通常的用户间、批次间、日间的差异是怎样的？
黑色和橙色的线代表使用同一批次试剂，由两名不同的技术人员在不同的日期进行检测。红色线代表使用不同批次的试剂进行检测（也在不同的日期进行）。一些结论：
- 技术重复 CV 小于 3%
- 与 200 bp 目标值的偏差为6 – 8%
- 用户间和日间差异小于 4 bp
- 试剂批次间的差异约为 25 – 30 bp（在这两种情况下，与目标值的差异均小于 8%）
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